（1）潘氏细胞中溶菌酶分拣、分泌依赖于肠道共生菌。
我们首先发现在无菌小鼠肠腔中缺乏溶菌酶，而同样来源于潘氏细胞的隐窝肽在无菌小鼠与普通SPF小鼠的肠腔中没有差异（图1）。这一结果说明了潘氏细胞在无菌条件下溶菌酶分拣与分泌出现异常。在无菌小鼠中，溶菌酶在mRNA水平与SPF小鼠没有差异（图2a）。通过体外隐窝培养，我们发现溶酶体抑制剂（leupeptin）可以恢复无菌小鼠潘氏细胞中的溶菌酶（图2b,c），从而揭示了在无菌条件下，溶菌酶在溶酶体中发生降解，从而不能被分泌到肠腔中。另外，在无菌小鼠中移植肠道菌群，可以有效恢复肠腔中的溶菌酶，进一步说明了溶菌酶分拣、分泌依赖于肠道共生菌。
图1：小鼠肠道中的溶菌酶依赖于肠道共生菌。用整体组织免疫荧光染色（Whole-mount immunostaining）检测SPF、GF及移植正常菌群的GF（ex-GF）小鼠肠腔中的溶菌酶（a）和隐窝肽（b）。Lectin-HPA用作染色对照，结合肠腔中的高度糖基化的黏液蛋白。标尺，20µm。
图2：溶菌酶在无菌小鼠的潘氏细胞中被降解。（a）溶菌酶的mRNA水平。（b）体外培养的无菌小鼠来源的隐窝小体，用溶酶体抑制剂(leupeptin)或对照处理后，免疫荧光染色分析溶菌酶和隐窝肽。标尺，10µm。（c）体外培养的SPF 小鼠及无菌小鼠来源的隐窝小体，用溶酶体抑制剂(leupeptin)或对照处理后，免疫印迹分析溶菌酶。
（2）NOD2在肠道共生菌介导的溶菌酶分拣中发挥关键作用。
我们同样发现Nod2—/—小鼠肠腔中缺乏溶菌酶(图3a)，而溶酶体抑制剂(leupeptin)可以恢复Nod2—/—小鼠潘氏细胞中的溶菌酶(图3b,c)。NOD2的配体胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide, MDP)可以有效的恢复无菌小鼠潘氏细胞中的溶菌酶(图4a)，而且给无菌小鼠喂食MDP可以恢复小鼠肠腔中的溶菌酶(图4b,c)，有力支持了NOD2作为共生菌来源的肽聚糖的受体在潘氏细胞的溶菌酶分拣中发挥重要作用。
图3：溶菌酶在Nod2—/—小鼠的潘氏细胞中被降解。（a）用整体组织免疫荧光染色（Whole-mount immunostaining）检测野生型及Nod2—/—小鼠肠腔中的溶菌酶。标尺，20 m。（b）体外培养的SPF小鼠及无菌小鼠来源的隐窝小体，用溶酶体抑制剂(leupeptin)或对照处理后，免疫印迹分析溶菌酶。（c）体外培养的无菌小鼠来源的隐窝小体，用溶酶体抑制剂(leupeptin)或对照处理后，免疫荧光染色分析溶菌酶和隐窝肽。标尺，10µm。
图4：NOD2的配体MDP可以恢复无菌小鼠中的溶菌酶。（a）体外培养的无菌小鼠来源的隐窝小体，用MDP或对照处理后，免疫荧光染色分析溶菌酶和隐窝肽。标尺，10 m。（b,c）用整体组织免疫荧光染色（Whole-mount immunostaining）检测无菌小鼠在MDP喂食及对照处理后的肠腔中的溶菌酶。标尺，20µm。
（3）NOD2定位于潘氏细胞的分泌囊泡上，招募在蛋白分拣中发挥重要作用的Rab2a蛋白。
已有文献报道在人的潘氏细胞中NOD2定位于潘氏细胞的分泌囊泡上，在小鼠中尚无类似报道。我们发现在SPF小鼠中NOD2确实定位于潘氏细胞的分泌囊泡上（图5）。而在无菌小鼠中，定位于分泌囊泡的NOD2大量减少。说明NOD2的囊泡定位依赖于肠道共生菌。我们发现了在Nod2—/—潘氏细胞中负责分泌囊泡分拣的重要GTP水解酶Rab2a不能正常定位于分泌囊泡（图6a,b）。已有的研究发现了Rab2a突变可以造成神经细胞中的一个21个氨基酸的神经肽被错误分拣到溶酶体中发生降解。而当在野生型潘氏细胞敲低Rab2a时，也同样造成了溶菌酶在溶酶体中的降解（图6c），从而说明了Rab2a的确在潘氏细胞中控制着溶菌酶的分拣。在无菌小鼠的潘氏细胞中，Rab2a也不能正常定位于分泌囊泡（图7a,b），说明了共生菌招募了NOD2定位于分泌囊泡，NOD2更进一步招募了Rab2a控制溶菌酶分拣。
图5：NOD2定位于潘氏细胞的分泌囊泡上，并依赖于肠道共生菌。（a）NOD2在潘氏细胞中的免疫荧光染色。标尺，10µm。（b）定位于分泌囊泡（DCVs）上的NOD2的定量分析。
图6：NOD2招募Rab2a至分泌囊泡指导溶菌酶分拣。（a）免疫荧光染色分析WT及Nod2—/—小鼠隐窝中的溶菌酶和隐窝肽。标尺，10µm。（b）定量分析Rab2a阳性的分泌囊泡（DCVs）。 （c）在体外培养的隐窝小体中敲低Rab2a或对照后，免疫荧光染色分析溶菌酶和隐窝肽。标尺，10µm。
图7：在无菌条件下，Rab2a不能定位于分泌囊泡上。（a）免疫荧光染色分析小鼠隐窝中的Rab2a和Rab10。标尺，10µm。（b）定量分析Rab2a阳性的分泌囊泡（DCVs）。
（4）RIP2在溶菌酶分拣中的作用
RIP2是NOD2感知细菌肽聚糖通路中关键的衔接蛋白，是激活NOD2下游NFKB信号所必需的。然而，RIP2是否参与NOD2介导的溶菌酶分拣是未知的，所以我们通过免疫荧光染色的方法分析了溶菌酶在Rip2—/—潘氏细胞中的分布（图8）。结果发现了在Rip2—/—潘氏细胞跟Nod2—/—潘氏细胞的溶菌酶染色是类似的，从而说明了RIP2也参与了潘氏细胞中溶菌酶的分拣。
图8： RIP2参与潘氏细胞中溶菌酶的分拣。免疫荧光染色分析小鼠隐窝中的溶菌酶和隐窝肽。标尺，10µm。
