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李栋组开发新型超分辨成像技术揭示细胞器互作新现象

发布时间:2018-10-26

  10月25日,金沙集团1862cc李栋课题组与美国霍华德休斯医学研究所Eric Betzig博士、Jennifer Lippincott-Schwartz博士合作在Cell杂志发表了题为Visualizing intracellular organelle and cytoskeletal interactions at nanoscale resolution on millisecond timescales的论文,详细介绍了一种观测细胞内动态过程的新技术——掠入射-结构光照明超高分辨率显微成像技术(GI-SIM, Grazing Incidence Structured Illumination Microscopy),该技术克服了全内反射荧光成像(TIRF)的成像深度局限,实现了快速(266帧/秒)、高分辨率(97nm)的活细胞超分辨成像,为解析细胞中细胞器(内质网、线粒体等)膜相互作用及微管功能的研究提供了新的洞见。

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  在真核细胞中,细胞器与细胞骨架实时发生高度动态、同时又被严密调控的相互作用,以协调复杂的细胞功能。观测这些动态过程,需要对细胞的内部环境进行非侵入性的、长时程的成像,并要求成像技术应具备非常高的时-空分辨率,以及很低的成像背景。为达到这些通常情况下相互矛盾的目标,李栋课题组等发展了掠入射-结构光照明超高分辨率显微成像技术(GI-SIM, Grazing Incidence Structured Illumination Microscopy)这种新的成像方法。该方法能够突破现有技术局限,对细胞基底膜附近的动态过程以97nm分辨率,266帧/秒的速度,进行超过数千时间点的持续成像。

  图1. 比较TIRF, WF, GI SIM的照明方式(A). 由全内反射(TIRF)产生的倏逝波光场呈指数衰减的轴向强度剖面,这限制了它的光照深度在质膜附近。因此,在相应的长程结构照明显微镜下只能看到ER网络的碎片。(B). 传统的宽视场(WF)模式照亮整个细胞体积,这样对焦结构如皮质ER被对焦背景遮挡。(C). 临界入射(GI)产生的薄层厚度与聚焦深度匹配(DOF)的高数值孔径目的是照亮整个体积的基底细胞皮层,包括皮质ER网络,在相应的GI-SIM图像中有最小的失焦背景。

  利用多色GI-SIM技术,李栋课题组研究了多种细胞器与细胞骨架的快速动态相互作用,为人们提供了对这些结构之间复杂行为的新认识。精确测量微管生长或者收缩事件有助于区分微管动态不稳定性模型。分析内质网与其它细胞器或者微管的相互作用,揭示了新的内质网重塑机制(微管解聚端牵引、搭便车和微管非依赖三种管状内质网延伸方式);研究还发现了内质网-线粒体接触点能够促进线粒体的分裂与融合(约60%的线粒体融合事件发生在线粒体与内质网的接触位点,并且与内质网接触的线粒体融合事件通常快于那些没有与内质网接触的融合事件);首次观测到处于运动状态的溶酶体可引起管状内质网的瞬时断裂;首次在哺乳动物细胞中证实不同种细胞器间存在广泛的“搭便车”(Hitchhiking)互作现象,并观测到线粒体、内质网等细胞器的形态改变和迁移可通过搭载到其它正在运动的细胞器上实现,而无需其直接招募马达蛋白。


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图2. GI-SIM能快速揭示MTs和ER网络的动态不稳定性。图中显示沿内质网小管的子域随时间变化的延时SIM图像。青色和橙色箭头表示两个收缩部位的形成和消失。在7.5 ms时,这些子域在GI-SIM图像(左)中得到了很好的解析,但在衍射受限的GI图像(右)中却无法清晰地观察到。
 
  图3. 管状内质网的形成机理(A). 在活性COS-7细胞中内质网网络(洋红色)重排对MTs(绿色)的依赖(可参考视频S2. 第一部分);(B). 管状ER产生滑动机制的延时成像。 \
图4. 管状内质网在线粒体分裂融合中的作用。(C). 内质网-线粒体接触点的典型线粒体分裂过程的延时图像; (D). 内质网-线粒体接触点的典型线粒体融合过程的延时图像。
图5. 内质网相互作用调节了内体或溶酶体的运输。(A). 在COS-7细胞中,微管(黄色)、内质网 (洋红色)和内体或溶酶体(绿色)相互作用的全视场图像; (B). 延时图像说明内质网多边形自发收缩到内体或溶酶体大小的过程。

  技术展望:

  GI-SIM提供了超高分辨率、高速、多色成像,以及低光漂白、低光毒性的组合优势,因而非常适合于细胞内动态生命过程的研究。与TIRF或TIRF-SIM相比,GI-SIM技术能够探测到的样品深度能达到上述技术的大约10倍;并能获得比之前强10倍的荧光信号。与SDCM相比,GI-SIM的空间分辨率显著提高2倍,成像速度也显著提高近10倍;与其它的超高分辨率方法相比,GI-SIM在时间-空间分辨率上取得了更好的平衡,并具备低光漂白及光毒性特征,实现在细胞大小的视场中进行活细胞成像。此外,荧光基团的光物理性质的持续提升,也将为GI-SIM技术获得超过97nm分辨率与266帧/秒成像速度的性能提升提供进一步的保证。

  GI-SIM技术仍具备进一步提升改进的可能性。李栋课题组报道的GI-SIM技术,其成像速度高达266帧/秒/颜色,高于许多成对的细胞器相互作用研究需要的速度。若结合近期发展的谱分解方法,进行高光谱超高分辨率成像,可为6个或者更多细胞器多方相互作用的同期实时成像研究提供可能性。此外,目前GI-SIM是一种严格的2D技术,通过多NA激发,并辅以更多的原始图像数据,有可能实现对活细胞基底膜附近动态过程的3D解析。

  李栋课题组发展的GI-SIM方法,提供了获得超高时-空分辨率,以及对活细胞产生最小损伤性的成像途径,满足了对活细胞开展细胞内动态成像的需求。该技术具有广泛的应用前景,为研究体外培养细胞,或者对组织边缘细胞内极为微小,并且高度动态的相互作用过程,打开了一个新窗口。我们期待以后随着技术的革新,开发出更高空间分辨率和时间分辨率的成像方法,可以用来观测活细胞或者组织中的分子的动态变化过程。

  (注:解读文章转载自BioArt微信公众号(原文链接:https://mp.weixin.qq.com/s/kCMSD1agljKBJ1E35TOlBw ),解读专家钟桂生博士为哈佛大学庄小威教授的博后,现为上海科技大学生命学院PI,主要从事超分辨显微成像结合神经生物学的相关研究。)


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