1、结核分枝杆菌DNA聚合酶beta亚基的结构解析

Beta clamp是DNA聚合酶III的主要组成部分，也是基因组复制所必须的。它具有不同DNA修复蛋白和细胞周期调控蛋白的功能，因而成为一个潜在的药物靶标。为揭示Beta clamp功能，本研究开展了结核分枝杆菌中Beta clamp晶体结构的解析。结核分枝杆菌的Beta clamp形成一个头尾环形二聚体，每个亚基有3个结构域。每个结构域包含2个α螺旋线在内，倚着2个β sheets在外。已有研究表明大肠杆菌的Beta clamp结合蛋白有一个保守的LF序列，这是结合到sliding clamp疏水区域的关键。本研究还开展了Beta clamp与DNA聚合酶IIIα和δ亚基肽的亲和活性，表明在α和δ结合到结核分枝杆菌sliding clamp，LF序列也起着重要作用（该研究结果发表在Biochemical Biophysical Research Communication, 2011, 405, 272-277.）。

2、结核分枝杆菌非同源末端连接修复机制研究

非同源末端连接（NHEJ）修复途径是真核生物中广泛存在的维护基因组稳定的重要机制，但近期研究发现在少数原核生物特别是大多数的病原微生物中也有此系统，并且与病原菌在宿主中的生存以及耐药的产生至关重要。结核菌主要是通过呼吸途径入侵人类的肺部巨噬细胞来传播结核病，但巨噬细胞会利用产生活性氧或活性氮中间体作为抗菌剂来消化结核分枝杆菌。活性氧或活性氮中间体对结核菌的损伤是NHEJ的修复底物，因此NHEJ的功能对于结核菌在巨噬细胞中的生存是极其重要的。通过本课题的研究有望回答结核菌如何应对人体免疫系统攻击造成的DNA损伤，以及其在潜伏状态时如何应对双链断裂损伤等问题，为揭示结核菌的感染、潜伏和致病机理提供重要线索，为发展结核病的控制策略提供新的理论依据。相比于真核生物的NHEJ系统研究来说，对原核生物NHEJ修复途径研究报道较少，且集中在对DNA末端结合蛋白Ku和依赖ATP的连接酶的相关生化、结构以及遗传学方面的研究，尚不清楚是否还有其他成分参与该途径、NHEJ与同源重组修复如何协调作用以及NHEJ功能异常与结核菌的致病和耐药发生的相关性。本研究首次发现Sir2参与细菌非同源末端连接修复途径。通过串联亲和纯化筛选，我们在分枝杆菌中鉴定出一个NAD依赖性脱乙酰酶，它是真核生物Sir2蛋白的同系物，并且直接与Ku蛋白作用。体外GST pull-down实验结果表明Sir2直接作用于LigD蛋白。基于质粒的末端连接实验显示在缺失sir2的突变体，DSB修复效率降低2倍。另外，∆sir2应变为约10倍，在固电离辐射比野生型更敏感。我们的结果表明在分枝杆菌中Sir2可能与非同源末端连接的Ku和LigD关系密切（该研究结果发表在Plos One, 2011）。