章佩君教授（左二）与孙飞研究员（左一）等合影

　　9月14日，应孙飞研究员邀请，来自匹兹堡大学生物医药学院结构系的章佩君教授对生物物理所进行了学术访问，并就HIV病毒和宿主细胞相互作用过程的结构生物学问题，做了一场题为“Visualizing Virus and Host Cell Interactions Using Cryo-FIB and Correlative Microscopy”的学术报告。孙飞研究员、朱平研究员、邓红雨研究员和徐涛研究组、电镜平台以及其他各组的师生参加了讲座及交流。

　　章佩君教授早年主要从事材料学相关的电子显微成像研究，目前的研究工作主要集中于四个方面的研究：1. 在HIV病毒和宿主相互作用过程的早期阶段，病毒颗粒的衣壳的组装、成熟等相关结构生物学研究；2. 在细菌的趋化性中信号传导的分子机制研究；3. 细胞内吞过程中的结构研究；4.发展冷冻电镜和冷冻电子断层三维成像的方法学。

　　报告中，章教授结合其研究组的研究方向，以HIV病毒攻击宿主早期阶段的结构研究为例，重点向我们展示了其实验室如何利用冷冻聚焦离子束技术和光电联合成像技术对HIV感染早期的结构生物学的研究。HIV病毒在攻击宿主细胞的早期过程中，病毒粒子的衣壳蛋白会发生解聚、暴露其基因组并且随后利用其相关转录酶来攻击宿主细胞。

　　长期以来，人们对于这个过程一直没有一个直观的认识，特别是衣壳蛋白解聚与膜融合（病毒的包膜与宿主细胞质膜的融合）之间的发生的先后顺序一直是人们的疑问。一方面由于病毒侵染宿主细胞是一个高度动态的、不均一的、偶发性的过程，另一方面由于HIV的病毒粒子的大小在100nm左右，因此在传统的电子断层三维图像中很难观察到目标病毒颗粒。最初，人们利用传统的荧光显微技术定位已被感染的细胞中的病毒粒子，然后将细胞进行固定、脱水、包埋和常规切片技术，最后通过常规的电子断层三维成像共定位病毒粒子，从而实现对病毒粒子的原位观察。但是，这其中依然存在两个方面的问题，一是光学成像与电子成像之间的时间间隔超出了大多数的生物过程发生的时间尺度，很难对动态的过程进行联合成像；二是常规的电子断层三维成像是利用样品的树脂切片，而在切片制作过程会在结构上造成很多的人工假象，使观察结果不能接近生物体的生理状态。因此，人们迫切需要利用两种成像模式对动态的过程在接近生理状态下进行观察。

　　章教授实验室利用自己发展的冷冻荧光显微成像平台，将激光共聚焦的动态观察与冷冻电子断层三维成像进行联合，从而在空间和时间维度上做到了两种成像方式的联合。他们利用此技术研究了HIV病毒侵染宿主细胞的早期阶段，并利用具有GFP标记病毒的Vpr蛋白（GFP-vpr）、疱疹性口炎病毒的包膜糖蛋白（VSV-G）以及野生型病毒衣壳蛋白的野生株和具有GFP-vpr 、VSV-G和衣壳蛋白E45A的突变株两种重组病毒颗粒分别感染Hela细胞，先后进行光学和电子显微冷冻成像。研究结果显示病毒的衣壳蛋白的解聚是发生在膜融合之后，并且是一个多步骤的、时间跨度在40min左右的过程。但是，由于电子成像对样品厚度的限制，他们只能对细胞边缘区域进行成像。

　　由于真核细胞的异质性，细胞在不同部位表现出具有不同的厚度。同时，单个细胞的直径大小在10-100um左右，这远大于电子断层成像的500nm的厚度。因此要实现光电联合必须使样品具有合适的厚度。传统的冷冻切片技术可以实现这一目的，但是在这个过程中也会出现诸如样品压缩等难以解决的问题。另一方面，近些年来由于聚焦离子束研磨技术（FIB-Milling）的发展，人们可以在冷冻或者常温条件对生物样品样品进行精确的切割。与此同时，研究人员还将这一技术与扫描或者电子透射成像进行联合，从而使样品在无人为破坏的情况下变薄并且成像。章教授实验室利用冷冻的FIB-Milling技术将冷冻电子断层显微成像和冷冻光学成像实现了很好的联合，并且对HIV感染的早期细胞进行细胞内大范围的观察。

　　章教授的报告深入浅出，与会者针对冷冻光电联合技术中的诸多技术难点与章教授进行了深入的讨论。访问期间，章教授在朱平研究员、孙飞研究员等的陪同下参观了生物物理所生物成像中心的Titan Krios高分辨率场发射低温透射电镜系统，高分辨率光学成像平台等其它科研平台，并对光电联合技术的发展进行了实地的指导。

（供稿：孙飞组 陆久维）